試樣中加入同位素內(nèi)標(biāo)，用氫氧化鈉-甲醇溶液進(jìn)行酯鍵斷裂反應(yīng)，3 -氯- 1,2-丙二醇酯、2-氯-1,3-丙二醇酯和縮水甘油酯分別轉(zhuǎn)化為游離態(tài)3 -氯- 1,2-丙二醇（3-MCPD）、2-氯-1,3-丙二醇（2-MCPD）、縮水甘油（Gly）和相應(yīng)的脂肪酸甲酯；以酸性溴化鈉溶液進(jìn)行中和，生成的縮水甘油轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的 3-溴-1,2-丙二醇（3-MBPD）；試液經(jīng)凈化去除脂肪酸甲酯等雜質(zhì)后，進(jìn)行苯基硼酸衍生，以氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)法定量。

酯鍵斷裂反應(yīng)中，生成的游離態(tài)3-MCPD在堿性條件下會(huì)部分轉(zhuǎn)化成縮水甘油，經(jīng)酸性溴化鈉溶液作用生成3-MBPD；同位素13C3-3-MCPD在相同條件下轉(zhuǎn)化成13C3-3-MBPD的比例和3-MCPD轉(zhuǎn)化成3-MBPD的比例一致，通過轉(zhuǎn)換關(guān)系對(duì)試液中總縮水甘油含量進(jìn)行修正，得到試樣中縮水甘油酯含量。

實(shí)驗(yàn)用到的標(biāo)準(zhǔn)品信息見下表：

表1 標(biāo)準(zhǔn)品信息

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配置

氯丙醇酯混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（10 μg/mL）：分別準(zhǔn)確移取1 mL 100 μg/mL 3-MCPDE、2-MCPDE標(biāo)準(zhǔn)溶液至10 mL容量瓶中，用甲苯定容至刻度。于-20 ℃保存，保存期 6個(gè)月。

氯丙醇酯混合標(biāo)準(zhǔn)工作液CaL I（2 μg/mL）：準(zhǔn)確移取1 mL 10 μg/mL 氯丙醇酯混標(biāo)中間液，用甲苯定容至5 mL。于-20 ℃保存，保存期 3個(gè)月。

氯丙醇酯混合標(biāo)準(zhǔn)工作液CaL II（0.2 μg/mL）：準(zhǔn)確移取1 mL 2 μg/mL 氯丙醇酯混合標(biāo)準(zhǔn)工作液I，用甲苯定容至10 mL。臨用現(xiàn)配。

縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)中間液（10 μg/mL）：準(zhǔn)確移取1 mL 100 μg/mL 縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)溶液至10 mL容量瓶中，用甲苯定容至刻度。于-20 ℃保存，保存期 6個(gè)月。

縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)工作液CaL I（2 μg/mL）：準(zhǔn)確移取1 mL 10 μg/mL 縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)中間液，用甲苯定容至5 mL。于-20 ℃保存，保存期 3個(gè)月。

縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)工作液CaL II（0.2 μg/mL）：準(zhǔn)確移取1 mL 2 μg/mL 縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)工作液I，用甲苯定容至10 mL。臨用現(xiàn)配。

內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（13C3-3-MCPDE:2µg/mL，D5-2-MCPDE:2µg/mL，D5-GE：2µg/mL）：分別準(zhǔn)確移取0.4 mL 50 μg/mL 13C3-3-MCPDE、D5-2-MCPDE和D5-GE標(biāo)準(zhǔn)溶液到10 mL容量瓶中，用甲苯稀釋至刻度。于-20 ℃保存，保存期 3個(gè)月。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制

按照下表所示，分別配制氯丙醇酯標(biāo)準(zhǔn)曲線和縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)曲線。加入甲苯、叔丁基甲醚（tBME）、內(nèi)標(biāo)工作溶液和相應(yīng)的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照“樣品前處理"進(jìn)行操作，上機(jī)檢測(cè)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表2 氯丙醇酯標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

表3 縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

標(biāo)準(zhǔn)品配制注意事項(xiàng)：

1、氯丙醇酯濃度均以對(duì)應(yīng)的氯丙醇計(jì)，縮水甘油酯濃度以縮水甘油計(jì)，定量計(jì)算中需特別注意。

2、如使用純品型標(biāo)品，需注意計(jì)算標(biāo)品的純度和對(duì)應(yīng)的折算系數(shù)。建議選擇安譜璀世溶液型標(biāo)品，進(jìn)行稀釋配制，操作更加方便。

3、為確定反應(yīng)過程中3-MCPD在轉(zhuǎn)化成縮水甘油的含量，本方法需要分別配制氯丙醇酯和縮水甘油酯兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線，但內(nèi)標(biāo)為同位素標(biāo)記，可以不進(jìn)行分開配制，將13C3-3-MCPDE、D5-2-MCPDE和D5-GE三者混合使用。

試劑配置：

硫酸水溶液（25%）：將25 mL硫酸轉(zhuǎn)移至含有50 mL純水的100 mL容量瓶中。用純水稀釋至刻度線并混勻。

酸性溴化鈉溶液（溴化鈉600 g/L）：將60 g溴化鈉溶解于70 mL純水中。將溴化鈉溶液轉(zhuǎn)移至含有3.5 mL 25%硫酸溶液的100 mL容量瓶中。用純水稀釋至刻度線并混勻。

氫氧化鈉-甲醇溶液（0.35 mol/L）：稱取1.4 g 氫氧化鈉，加入甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混勻，轉(zhuǎn)移至塑料瓶中，儲(chǔ)存于10℃下。臨用現(xiàn)配。

苯硼酸溶液：稱取12.0 g苯硼酸，加入100 mL的95%丙酮水溶液，混勻。溶液可在室溫下儲(chǔ)存三個(gè)月。

乙_醚-石油醚溶液（1+1）：量取乙_醚和石油醚各100 mL，混勻。

1%乙二醇溶液：移取 100 µL乙二醇，加水定容至10 mL，混勻。

試樣提取：

準(zhǔn)確稱取嬰幼兒配方奶粉試樣0.5 g（精確至1 mg）于40 mL玻璃螺紋樣品瓶中，準(zhǔn)確加入100 µL混合內(nèi)標(biāo)工作液（2 µg/mL）；加入2 mL 65 ℃±5 ℃水，渦旋混勻，再加入1 mL氨水，蓋塞渦旋混勻，在65℃±5℃水浴下振蕩30 min，取出后冷卻至室溫。加入3 mL乙醇，渦旋后加入5 mL乙_醚，振搖5 min，然后加入5 mL石油醚，繼續(xù)振搖5 min。待溶液靜置分層后，取上層溶液于40 mL玻璃樣品瓶中；再加入乙_醚和石油醚各5 mL，重復(fù)萃取1次，合并有機(jī)相于40℃下氮吹濃縮至干，用2 mL乙_醚-石油醚溶液（1+1）淋洗樣品瓶?jī)?nèi)壁，將洗液轉(zhuǎn)移至8 mL玻璃螺紋樣品瓶中，于40 ℃下氮吹至干，供堿水解。

堿水解（酯鍵斷裂反應(yīng)）：

向提取樣品中加入100 µL甲苯、200 µL叔丁基甲醚（tBME）。渦旋混勻30 s，10°C水浴冷卻6 min。

加入預(yù)冷的200 µL氫氧化鈉-甲醇溶液（0.35 mol/L），渦旋混勻10 s，繼續(xù)10°C水浴7 min進(jìn)行酯鍵斷裂反應(yīng)。然后加入600 µL酸化溴化鈉水溶液（溴化鈉600 g/L），渦旋混勻10 s，停止反應(yīng)。讓溫度穩(wěn)定在室溫靜置至少5 min，以使所有縮水甘油完_全轉(zhuǎn)化為3-MBPD。

試樣凈化：

在樣品中加入600 µL異辛烷，渦旋混勻10 s，取出上層有機(jī)相，棄去。再加入600 µL異辛烷，渦旋10 s，然后取出上層有機(jī)相，棄去，注意不要取到任何水層。

衍生化反應(yīng)：

向凈化液中加入100 µL苯基硼酸溶液，渦旋30 s后，加入100 µL 1%乙二醇溶液和1.0 mL異辛烷，渦旋，靜置分層，必要時(shí)可離心使分層徹_底，取上層溶液至裝有約0.3 g無水硫酸鈉的玻璃樣品瓶中，渦旋混勻10 s，提取液過0.22 μm的疏水性PTFE針式濾器后供氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行測(cè)定。

前處理注意事項(xiàng)：

1、0.35 mol/L甲醇鈉溶液建議存放在4℃條件下，建議至少存放2h以上，臨用前拿出；

2、10°C低溫酯交換反應(yīng)時(shí)需盡量將整個(gè)螺紋瓶浸泡在水中，以保證螺紋瓶?jī)?nèi)溫度穩(wěn)定；

3、前處理過程中盡量避免使用塑料耗材，可使用玻璃螺紋瓶、玻璃巴斯德吸管、玻璃移液管、手動(dòng)進(jìn)樣針等耗材，建議進(jìn)行方法空白實(shí)驗(yàn)監(jiān)控過程本底情況；

4、建議使用疏水性PTFE針式濾器進(jìn)行過濾；

5、前處理過程中會(huì)存在3 -氯- 1, 2-丙二醇酯轉(zhuǎn)換生成的縮水甘油（Gly）的副反應(yīng)，在上述條件下，13C3-3 -氯- 1,2-丙二醇棕櫚酸雙酯（13C3-3-MCPD-PP）轉(zhuǎn)換為13C3-Gly的轉(zhuǎn)換率需控制在10%左右，如轉(zhuǎn)換率過高需排查前處理過程，轉(zhuǎn)化率偏高的主要原因可能是溫度控制不理想導(dǎo)致；

6、在上述條件下，2-MCPD可轉(zhuǎn)化為縮水甘油的比率<1%，可以忽略不計(jì)。

儀器維護(hù)注意事項(xiàng)：

1、隨著進(jìn)樣次數(shù)的增加，儀器輕微污染，目標(biāo)物保留時(shí)間可能發(fā)生偏移；

2、該實(shí)驗(yàn)對(duì)儀器污染比較嚴(yán)重，儀器受到嚴(yán)重污染后，可能導(dǎo)致目標(biāo)物響應(yīng)降低、分離度變差等情況，需注意儀器的清洗維護(hù)，包括進(jìn)樣針的清洗，離子源的清洗，色譜柱的老化等；

3、如儀器配制程序升溫進(jìn)樣口和反沖功能，可明顯降低對(duì)儀器的污染程度。

4、建議色譜柱加裝2m相同固定相的預(yù)柱，定期對(duì)預(yù)柱進(jìn)行更換，可延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命。

6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)

以標(biāo)準(zhǔn)工作液中標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量（以醇計(jì)）為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品與對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)，繪制3-MCPDE、2-MCPDE 和 GE 的標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線見表5。

以氯丙醇酯標(biāo)準(zhǔn)系列衍生液中 3-MCPD 與13C3-3-MCPD 的峰面積比為橫坐標(biāo)，3-MBPD 與13C3-3-MBPD 的峰面積比為縱坐標(biāo)，繪制 3-MCPD 轉(zhuǎn)化為 3-MBPD 的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于計(jì)算試液中 3-MCPDE水解產(chǎn)物 3-MCPD 轉(zhuǎn)化為 3-MBPD 的峰面積，標(biāo)準(zhǔn)曲線見表5。

表5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

6.2 加標(biāo)回收率數(shù)據(jù)

本次實(shí)驗(yàn)方法空白未檢出氯丙醇酯和縮水甘油酯，奶粉樣品中3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和縮水甘油脂肪酸酯的本底含量分別為0.033、0.019、0.008 mg/kg，其中縮水甘油酯含量的計(jì)算已經(jīng)校正了3 -氯- 1,2-丙二醇酯的轉(zhuǎn)換影響。

樣品中3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和縮水甘油脂肪酸酯的回收率數(shù)據(jù)見下表。

表6 奶粉基質(zhì)的加標(biāo)回收率數(shù)據(jù)（n=3）

數(shù)據(jù)計(jì)算注意事項(xiàng)：

1、本實(shí)驗(yàn)3-氯丙醇酯使用13C3-3 -氯- 1,2-丙二醇棕櫚酸雙酯作為定量?jī)?nèi)標(biāo)；2-氯丙醇酯使用D5-2-氯-1,3-丙二醇硬脂酸雙酯作為定量?jī)?nèi)標(biāo)；縮水甘油酯使用D5-縮水甘油棕櫚酸酯作為定量?jī)?nèi)標(biāo)；

2、縮水甘油酯是通過前處理轉(zhuǎn)換為 3-溴-1,2-丙二醇（3-MBPD）進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)；

3、樣品中縮水甘油酯GE的計(jì)算需扣除3 -氯- 1, 2-丙二醇酯轉(zhuǎn)換生成的縮水甘油（Gly）的影響，轉(zhuǎn)換量（GE 的高估值）需要通過試液中 3-MCPD 轉(zhuǎn)化而成的 3-MBPD 的峰面積A1進(jìn)行計(jì)算，而A1需要通過3-MCPD 轉(zhuǎn)換 3-MBPD 的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算得到。計(jì)算中需注意不同計(jì)算目的的內(nèi)標(biāo)選擇。

4、樣品中氯丙醇酯濃度均以對(duì)應(yīng)的氯丙醇計(jì)，縮水甘油酯濃度以縮水甘油計(jì)，計(jì)算中需特別注意。

使用安譜實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品和相關(guān)耗材，參照國(guó)標(biāo)《GB 5009.191-2024 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氯丙醇及其脂肪酸乙酯、縮水甘油酯的測(cè)定》第二篇第一法，快速堿水解方法，使用同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和縮水甘油脂肪酸酯的回收率在90%-110%之間，RSD小于11%。該方法操作簡(jiǎn)便，快速，穩(wěn)定，能夠很好的滿足奶粉基質(zhì)中氯丙醇酯和縮水甘油酯的檢測(cè)。